活细胞成像系统介绍.ppt
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API DeltaVision Elite 活细胞成像系统介绍
医药研究中心 xxx
Deltavision OM0
Deltavision Spectris
Deltavision Core
Deltavision OMX V4
Deltavision Elite
DeltaVision 历史发展
2002年
2006年
2011年
2011年
1986年
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Robert Horvitz 线虫细胞程序性凋亡研究 2002年诺贝尔生理与医学奖
Elizabeth Blackburn 端粒与细胞衰老的研究 2009年诺贝尔生理与医学奖
DeltaVision产出众多国际顶级科研成果
逾2000篇文献 200余篇封面文章 300余篇Cell , Nature, Science
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为什么要做活细胞实验?
固定细胞观察仅能提供固定瞬间细胞的静态信息，无法反映细胞在正常生理生化条件下的状态 只有观察活细胞,才能深刻了解生命最基本单元CELL ”从形态到功能”到底发生了什么样的变化,才能最深刻地理解生命本质性的东西 只有通过活细胞实验得到的结果，才能更适合人类的需要
活细胞成像是趋势
以“live cell”为主题搜索SCI文章
DeltaVision成像系统的基础原理
快速去卷积(deconvolution)技术
(Gp:) object
PSF(Point Spread Function,点扩散方程)与镜头NA、介质等光路信息相关
DeltaVision成像系统的基础原理
快速去卷积(deconvolution)技术
(Gp:) 5mm
(Gp:) 原始图像
(Gp:) 5mm
(Gp:) 去卷积后
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DV vs. Confocal
(Gp:) Confocal (100x/1.4)
(Gp:) DV (100x/1.4)
(Gp:) TRITC
(Gp:) FITC
(Gp:) DAPI
(Gp:) Merge
(Gp:) 10mm
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DV vs. Confocal
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5mm
DV vs. 转盘共聚焦
10
10mm
DeltaVision Elite
活细胞培养装置：自动控温(RT~50℃)、预混5%CO2供给 倒置显微镜，使用玻底皿或腔室盖玻片 配有40×,60×,100×高数值孔径物镜 七色固态照明光源 电动高精度载物台 自动化控制台
活细胞工作站细胞培养系统
CO2流量 控制器
温度控制器
湿度控制器
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培养环境对细胞的影响——温度
不同样品需要不同的温度： 注意事项
植物实验不能高于28 ℃ 酵母要求30 ℃ ，heat shock后蛋白聚合 普通动物细胞37 ℃ 斑马鱼实验要求40 ℃ 大肠杆菌44℃时死亡
避免温差导致的气流扰动 避免温度变化引起的凝胶变形 避免高温引起的水分蒸发
目镜
10X air, 0.4NA 20X air, 0.75NA 40X air, 0.95NA 60X Oil, 1.42NA 100X Oil, 1.4NA
InsightSSI固态照明光源
冷光源，对细胞伤害小 光强稳定，光线均匀 波长选择范围广：从紫外到近红外 快速开关及不同波长快速切换：10ms 寿命长：1万小时
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InsightSSI固态照明光源
Standard：DAPI, FITC, TRITC, CY5 Live cell：CFP, GFP, YFP, mCherry Alexa：DAPI, FITC, A594, CY5
NanoMotion全自动3D载物台
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softWoRx图像获取软件
支持多达四个荧光通道和一个透射光通道同时采集 高速离子成像 3D光学切片 多点拍摄、细胞跟踪 自动对焦 延时拍摄 多视野拼接
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活细胞长时间动态/多维观察成像
目前可以做到六维(XYZ 三维，时间，不同点，不同波长)成像。
XYZ XYZ XYZ XYZλ
高速离子成像 结合高速 CCD 和高效的光路，对于快速的离子浓度的变化，最快可以50-100 帧/秒的速度获取图像。 细胞间钙信号的传递，使用Fluo‐3 标记胞内的钙离子
Point Visiting(多点观察)
Point List记录各点三维坐标
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Point Visiting(多点观察)
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Cell Tracking(细胞跟踪)
智能化的系统：细胞跟踪、自动对焦
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Cell Tracking(细胞跟踪)
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延时拍摄 通过软件精确的控制，拍摄的时间间隔从数秒到数小时不等，根据实验需求的不同，无论单一层面还是三维结构，都可以获得良好的效果。 正在分裂的Hela 细胞，其中绿色标记微管蛋白，红色标记染色体
图像拼接
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softWoRx软件图像处理功能
自动去卷积运算 支持批量化、队列化图像处理 交互式3D重构 图像数据统计 几何学和强度自动测量 物体运动轨迹分析 FRET分析 共定位分析
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3D 还原型去卷积处理 API 将显微镜的硬件设计和后期软件处理完美的结合在一起，通过对光学信号的3D 还原型去卷积处理，大大提高了显微镜的灵敏度和分辨率。 原始图像和经过3D 去卷积处理后图像的对比 A，B 为处理前，C，D 为处理后。
荧光共振能量转移(FRET) FRET就是采用非放射方法，在供体和受体相互靠得很近(1-10 nm)时，将光子能从一个受激发的荧光团(供体)转移到另一个荧光团(受体)。可以在活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间的相互作用 记录CFP/YFP，GFP/mcherry(RFP)的荧光强度，进一步计算出蛋白对之间精确的能量转移系数。
FRET的一种应用—检测细胞内Ca2+的浓度变化 将CFP和YFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内。当细胞内具有高的Ca2+浓度时，钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合，可诱发FRET，使受体蛋白YFP发出黄色荧光，细胞呈黄色。当细胞内Ca2+浓度低时，FRET几乎不发生，因此检测时CFP被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色。 细胞内Ca2+浓度通过荧光比率法测定：Ratio=I530/I490
细胞荧光测钙方法
非比例法测钙 没有光谱位移，只有荧光强度变化发生，不利于定量测定，但是激发光在可见光范围内，单激发单发射适合采集快速/高速细胞钙活动，有利于进行Ca2+ sparks(marks)等测定。 常用探针: Fluo-3，Fluo-4，Calcium Green等 比例法(Ratio)测钙 光谱发生位移、有利于对浓度进行定量的测定，但是需要用紫外光来激发。 常用探针: Indo-1、Fura-2等
荧光共定位分析 通过比较多个荧光通道的定位情况，即可知道他们在空间上和时间上的分布信息，进而得到相应的荧光信号是否存在相互作用、协同运动、定向运输等。 体外重组的病毒颗粒侵染细胞，绿色标记病毒的壳蛋白，红色标记病毒的RNA结合蛋白。病毒入侵前，由于病毒颗粒完整，绿色信号和红色信号共定位。病毒入侵细胞后，脱掉表面的壳蛋白，绿色信号和红色信号分离。
典型应用：细胞周期/细胞分裂
细胞骨架体系研究
微管
微丝
中间丝
主要应用领域
1)细胞迁移与细胞骨架; 2)细胞分裂与细胞周期; 3)细胞信号转导; 4)组织分化与发育; 5)囊泡和蛋白运输; 6)生理学和神经科学; 7)钙离子信号研究; 8)蛋白质与DNA 的相互作用; 9)宿主与病原体相互作用; 10)癌症研究; 11)药理研究; 12)生物物理研究。
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