肿瘤诊断和预后生物标志物的研究进展.ppt
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肿瘤诊断和预后生物标志物的研究进展
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结论 五个基因指纹与非小细胞肺癌的无复发生存期和总生存期密切相关
Dual-specificity phosphatase 6 (DUSP6), monocyte-to-macrophage differentiation associated protein (MMD), signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1), v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3 (ERBB3), lymphocyte-specific protein tyrosine kinase (LCK).
根据五个基因指纹RT-PCR检测的不同结果，用Kaplan-Meier法分析非小细胞肺癌患者的生存时间 Overall survival and relapse-free survival are shown for the 101 patients with NSCLC (Panel A and Panel B, respectively) and for the 59 patients with stage I or II disease (Panel C and Panel D, respectively). Overall survival is also shown for the independent cohort of 60 patients (Panel E), for the 42 patients in this cohort who had stage I or II disease (Panel F), and for the 86 patients described in an independent set of published NSCLC microarray data10 (Panel G).
设定为 10%假阴性 灵敏性 91 %, 特异性 73%
70 个预后相关基因表达谱 监督分析
(Gp:) van′t Veer et al., Nature 415, p. 530-536, 2002
(Gp:) 70 个与预后显著相关的基因
(Gp:) 肿瘤标本
(Gp:) 细胞增殖
(Gp:) 血管新生
(Gp:) 与细胞外基质的黏附
(Gp:) 局部侵犯
(Gp:) 进入血管内、存活、 外渗
(Gp:) 细胞增殖
(Gp:) 血管新生
(Gp:) 与细胞外基质的黏附
(Gp:) 未知功能的基因 (25)
70 个预后相关基因 与肿瘤细胞生物学各个方面均有关
(Gp:) 独立验证： Buyse et al, JNCI 2006;98:1183-92
(Gp:) 307 例
微阵列试验具有高度的可重复性 (99%)
Glas et al, BMC Genomics 2007
可重复性：重复试验
良好预后组患者没有一例复发
MammaPrint: 良好预后组 (n = 23) 不良预后组 (n = 144)
Straver M et al, Brit Cancer Res Treat 2009
Oncotype Dx的临床研究发展
发展高通量、实时RT-PCR技术来定量检测固定肿瘤标本中的基因表达 筛选出250个候选基因 在来自3个临床研究、共447例患者中检测250个候选基因与复发风险的相关性
(Gp:) 已发表的文献
(Gp:) 基因组数据库
(Gp:) 基于DNA 阵列的实验
16 个肿瘤相关基因 + 5 个参考基因 → Oncotype DX (复发风险指数)
Paik et al. NEJM. 2004.
如何评估乳腺癌患者的复发风险
传统病理学标准
(Gp:) Oncotype DX
(Gp:) 基因组学时代的新工具…
(Gp:) 年龄
(Gp:) 肿瘤大小
(Gp:) 淋巴结状态
(Gp:) ER/PR HER2
(Gp:) 肿瘤分期
(Gp:) 辅助化疗 基于电脑模式
细胞增殖 Ki-67 STK15 Survivin Cyclin B1 MYBL2
雌激素 ER PR Bcl2 SCUBE2
细胞侵润 Stromelysin 3 Cathepsin L2
HER2 GRB7 HER2
BAG1
GSTM1
参考基因 Beta-actin GAPDH RPLPO GUS TFRC
CD68
Paik et al, NEJM 2004;351:2817-26
16个肿瘤基因和5个参考基因构成了Oncotype DX基因组，根据这些基因的表达情况计算复发指数：
Oncotype DX 21-基因复发指数
复发指数
(Gp:) 40
(Gp:) 35
(Gp:) 30
(Gp:) 25
(Gp:) 20
(Gp:) 15
(Gp:) 10
(Gp:) 5
(Gp:) 0
(Gp:) 0
(Gp:) 5
(Gp:) 10
(Gp:) 15
(Gp:) 20
(Gp:) 25
(Gp:) 30
(Gp:) 35
(Gp:) 40
(Gp:) 45
(Gp:) 50
(Gp:) 复发指数
(Gp:) 十年内远处复发转移发生率
(Gp:) 95% C.I.
(Gp:) 复发指数
低危组 RS < 18 复发风险 = 6.8% C.I. = 4.0% - 9.6%
中危组 RS 18 - 31 复发风险 = 14.3% C.I. = 8.3% - 20.3%
高危组 RS ? 31 复发风险 = 30.5% C.I. = 23.6% - 37.4%
Paik et al, NEJM 2004;351:2817-26
Oncotype DX
低复发指数(RS)与最小化疗获益相关; 高复发指数(RS)与较好的化疗获益相关。 Oncotype DX复发指数提供了简洁、定量的个体预后信息，是具有统计学意义、与患者年龄、肿瘤大小和肿瘤分期分级无关的独立指标。
2006年诺贝尔生理学和医学奖
Andrew Z. Fire Craig C. Mello
C. elegans
Cho WC. MicroRNAs in cancer - from research to therapy. Biochim Biophys Acta - Rev Cancer 2010;1805:209-17
非编码-RNA：曾经被认为是毫无意义的「多余物」
tRNA rRNA snRNA tmRNA Rnase P RNA vRNAs gRNAs MRP RNA SRP RNAs 端粒酶RNA
转录/染色体结构调节因子 转录调节因子 蛋白功能调节因子 RNA/蛋白定位调节因子
RNA 转录
调节RNA miRNA siRNA piRNA 反义 RNA
编码蛋白的mRNA
非编码 RNA 转录
核仁小RNAs
管家 RNAs
非编码-RNA在复杂的基因组学中起重要作用
肺癌诊断和预后的独特microRNA表达谱
先天和后天的转变可能改变miRNA的表达，从而引起肿瘤靶基因的异常表达
Yanaihara et al, Cancer Cell 2006: - 采用miRNA微阵列法对104对原发性肺癌和相应非肿瘤肺部组织的miRNA表达谱做分析 - 43个miRNAs显示出了统计学差异
miRNAs是非编码的小RNA，在调节mRNA的反应和降解中发挥重要作用
一项单变量Cox比例风险回归模型全局排列检验显示：miRNA hsa-miR-155 和 hsa-let-7a-2 的表达与腺癌患者的结局相关
hsa-miR-155高表达或hsa-let-7a-2低表达的肺腺癌患者预后较差
Yanaihara N, et al. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis. Cancer Cell 2006, 9:189-198.
肺癌诊断和预后的独特microRNA表达谱
microRNAs在肿瘤诊断中的作用
应用原位RT-PCR技术，发现miR-221、miR-301和miR-376a 只在胰腺癌细胞中异常表达，但在细胞基质、正常腺泡或导管中无表达。 异常miRNA表达为胰腺肿瘤形成机制提供新的线索，可能是胰腺癌诊断的生物标志物。 Lee et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. Int J Cancer 2007;120:1046-1054. Cho WC. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol 2010. Cho WC. MicroRNAs in cancer - from research to therapy. Biochim Biophys Acta - Rev Cancer 2010;1805(2):209-217.
microRNAs在肿瘤预后中的角色
let-7 miRNA在肺癌中往往表达下降，而let-7 miRNA表达下调与患者术后生存期较短明显相关。 过表达的 let-7 miRNA 在A549肺腺癌细胞中能抑制体外肺癌细胞的生长。 Takamizawa et al. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res 2004;64:3753-3756.
microRNAs在肿瘤预后中的角色
采用miRNA微阵列，比较胰腺癌和正常胰腺组织以及慢性胰腺炎中miRNA的表达差异： miRNAs表达的差别可以用以鉴别胰腺癌、正常胰腺组织或/和慢性胰腺炎。 miR-196a-2的高表达能预测患者预后，高表达者往往活不过24个月。 Bloomston et al. MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis. JAMA 2007;297:1901-1908.
Cho WC. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol 2010. Cho WC. OncomiRs: the discovery and progress of microRNAs in cancers. Mol Cancer 2007;6:60.
相同的基因组 不同的蛋白组
基因以外的因素
在分子水平上描述蛋白和DNA的特性 是理清基因功能的关键
(Gp:) DNA
(Gp:) mRNA
(Gp:) t-RNA
(Gp:) t-RNA
(Gp:) t-RNA
(Gp:) t-RNA
(Gp:) 核糖体
(Gp:) (....)
(Gp:) 蛋白
(Gp:) CHO PO4
(Gp:) (....)
(Gp:) 翻译后修饰
(Gp:) X
(Gp:) X
(Gp:) 具有活性的蛋白
基因组学
功能性基因组学
蛋白组学
蛋白组学：引领21世纪生物科学
蛋白组学代表着对有机生物、器官和细胞器中所有蛋白的特性、分子量、结构和生物化疗、细胞功能加以明确 同时了解这些特性在空间、时间或不同生理状态下的变化
Cho WC. Proteomics - leading biological science in the 21st century. Science J 2004;56(5):14-17. Cho and Cheng. Oncoproteomics: current trends and future perspectives. Expert Rev Proteomics 2007;4(3):401-410.
传统方法 vs 高通量技术
蛋白组学的出现和应用
ESI: 电喷雾电离 MALDI: 基质辅助激光解吸电离 SELDI: 表面增强激光解吸离子化 TOF: 飞行时间
Cho and Cheng. Oncoproteomics: current trends and future perspectives. Expert Rev Proteomics 2007;4:401-10.
(Gp:) 化学表面 – 蛋白表达谱:
(Gp:) 疏水性 H50 – C9 链 H4 – C16 链
(Gp:) 阳离子 WCX2 - 羧酸盐
(Gp:) 金属离子亲和层析 金属螯合物 (Cu, Ni, Zn, Ga, Mn, …)
(Gp:) 常态 NP20 – SiO2
(Gp:) 阴离子 SAX2 – 4O 铵盐
(Gp:) PS-10 or PS-20 蛋白耦合
(Gp:) 抗体 – 抗原
(Gp:) 受体 – 配体
(Gp:) DNA – 蛋白
(Gp:) 生物表面 – 蛋白相互作用检测:
表面增强激光解吸离子化 (SELDI)
Cho WC. Proteinchip. In: Encyclopedia of Cancer, 2nd Ed. Springer 2009.
HTP 自动化
高度可重复的采样程序化流程
蛋白芯片系统 PCS4000
Aquarius (Tecan)
Biomek 2000 (Beckman)
Cho WC, et al. Clin Cancer Res 2004;10:43-52. Cho WC. Chin J Biotech 2006;22(6):871-876. Cho WC, et al. J Cell Biochem 2006;99(1):256-68. Cho WC, et al. Dis Markers 2006;22(3):153-66. Cho WC, et al. J Ethnopharmacol 2006;108(2):272-9. Cho WC, et al. Clin Chem 2007;53(2):241-250.
SELDI-TOF-MS技术 样本分溜、芯片结合和数据获得
?
生物标志物的发现
通过比较蛋白图谱可以容易地找出标志物 SELDI 技术比2D PAGE速度快，可重复性高 这一技术用以发现多种疾病的生物标志物，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺和膀胱癌
(Normal)
(Cancer)
Cho WC. Contribution of oncoproteomics to cancer biomarker discovery. Mol Cancer 2007;6:25.
蛋白质作为生物标志物
大多数情况下，相对于遗传基因，蛋白与实际疾病进程关系更为密切 蛋白是细胞功能的最终调节因子 大多肿瘤标志物都是蛋白质 绝大多数的药物靶点均为蛋白质
蛋白成分可能与机体疾病进展相关，因而可研发成为诊断标志物。
Cho WC. Cancer biomarkers. In: Methods of Cancer Diagnosis, Therapy and Prognosis. New York: Springer, 5 Jan 2010.
鼻咽癌 (Nasopharyngeal carcinoma)
香港人群中第七大常见肿瘤 鼻咽癌临床诊疗中的难题： 1. 诊断时往往已是晚期 (3/4期) 2. 复发常见 (其中>50%是CR的患者)
正常的鼻咽组织
鼻咽肿瘤
肿瘤位于右侧咽鼓管垫
Cho WC. Most common cancers in Asia-Pacific region: nasopharyngeal carcinoma. In: Cancer report of Asian-Pacific region 2010:284-289.
蛋白质芯片的应用： 鼻咽癌肿瘤生物标志物的发现
149 例鼻咽癌患者的血样 (未分化型鼻咽癌或分化差的鳞癌) 35 例正常人血样
(Gp:) 1021
(Gp:) 1386
(Gp:) 1524
(Gp:) 854
(Gp:) 600
(Gp:) 1600
胰蛋白酶消化
质谱分析 (肽图信息)
2-D 凝胶纯化
标本
寻找蛋白
数据库
识别鉴定
质谱数据采集进行蛋白识别鉴定
MS/MS法识别标志物
34/37离子与 血清淀粉样A配对
随访生物标志物11,695 Da水平(3例鼻咽癌复发，11例缓解)
Cho WC et al. Clin Cancer Res 2004;10:43-52
血清生物标志物在鼻咽癌复发患者化疗前后的改变
EP: Biomarker: 7,659 Da
GC: Biomarker: 7,765 Da
EP方案：依托泊苷和顺铂 GC方案：吉西他滨和顺铂
Cho WC et al. ProteinChip array profiling for identification of disease- and chemotherapy-associated biomarkers of nasopharyngeal carcinoma. Clin Chem 2007;53:241-50.
卵巢癌的基本数据
患病率 40/100,000 (每2500人里有一个) 每年新诊断患者23,000人 每年死亡人数14,000人 五年总生存率20-30% 75%患者初诊时已是晚期 (III/IV期) I/IIa期治愈率90% 因此，早期发现对提高患者总生存期至关重要
发现生物标志物的研究设计
(Gp:) 地区 1 (100)
(Gp:) 良性 (50)
(Gp:) 对照组 (30)
(Gp:) 良性 (90)
(Gp:) 对照组 (49)
(Gp:) III/IV期 (2)
(Gp:) I/II期 (35)
(Gp:) 良性 (26)
(Gp:) 对照组 63
(Gp:) III/IV期 (103)
(Gp:) I/II期 (20)
(Gp:) I/II期 (35)
(Gp:) Ca (41)
(Gp:) Other Ca 2 (20)
(Gp:) 对照组 (41)
(Gp:) Other Ca 1 (20)
(Gp:) Other Ca 3 (20)
(Gp:) 独立 确认
(Gp:) 交叉 比较
(Gp:) 候选 标志物
(Gp:) 地区 2 (176)
(Gp:) 地区 3 (164)
(Gp:) 地区 4 (63)
(Gp:) 地区 5 (142)
(Gp:) 多因素 模型
(Gp:) 蛋白 ID
(Gp:) 免疫化验 独立确认
(Gp:) 结果: 描述性数据 两组间 t-检验 表现 ROC曲线分析
(Gp:) 多因素模型 获得
(Gp:) 发现 1
(Gp:) 发现 2
总体表现
采用蛋白质芯片系统发现第I/II期卵巢癌的生物标志物 五个机构共503个样本 严密的交叉确认和独立确认研究设计 固定特异性 (97%) 三个标志物组 (载脂蛋白 A1、间α胰蛋白酶抑制物 IV和甲状腺素运载蛋白)：敏感性74% CA125：敏感性65% 固定敏感性 (83%) 三个标志物组：特异性94% CA125：特异性54%
(Gp:) 确认各个生物标志物的身份, 与相应的疾病生物学相联系
多标志物研究的开拓
(Gp:) Peak A Criteria
(Gp:) Peak B Criteria
(Gp:) Peak C Criteria
(Gp:) 肿瘤
(Gp:) 肿瘤
(Gp:) 正常
(Gp:) 正常
FDA于2009年9月11日批准了OVA1 试验
将生物标志物的发现从实验室开拓到临床应用中 基于一项前瞻性双盲的临床研究，纳入27个机构共516例患者 269 例患者只根据手术前信息进行评估 247 例患者根据手术前信息和OVA1结果进行评估 OVA1 检测能识别出额外的潜在恶性肿瘤患者 有助于指导手术决策
OVA1
首个FDA获准的基于蛋白水平的体外诊断多因素指数检测 首个FDA获准的用于卵巢癌术前和术后的预后检测 在血标本中检测 5 个蛋白 SELDI技术筛选出β2-微球蛋白、转铁蛋白、载脂蛋白A1、 甲状腺素运载蛋白 CA125 预测良恶性可能
Scientific American
Cho WC. Proteomic approaches to cancer target identification. Drug Discov Today: Ther Strategies 2007;4(4):245-250.
肿瘤治疗靶点
细胞生长 运动性 细胞存活 细胞增殖 血管新生
(Gp:) P
(Gp:) P
(Gp:) P
(Gp:) P
PDK1,2
生长因子 信号通路
基因转录
DNA 复制和修复
(Gp:) 1
(Gp:) 6
(Gp:) 3
(Gp:) 5
(Gp:) 8
(Gp:) 9
(Gp:) 10
(Gp:) 11
(Gp:) 2
细胞膜
细胞核膜
(Gp:) 12
(Gp:) 7
(Gp:) 4
(Gp:) 7
(Gp:) 7
1. 生长因子 2. 生长因子受体 3. 连接蛋白 4. 停靠蛋白/结合蛋白 5. 鸟嘌呤核苷酸交换因子 6. 磷酸酶和磷酸酯酶 7. 信号激酶 8. 核糖体 9. 转录因子 10. 组蛋白 11. DNA 12. 微管
微管动力学
RNA 转录
51
结肠癌中KRAS突变决定了对EGFR治疗的疗效
(Gp:) Mutant KRAS +EGFR -EGFR
(Gp:) Wild type KRAS +EGFR -EGFR
(Gp:) Amado et al. J Clin Oncol; 26:1626-1634 2008
52
结肠癌中KRAS突变决定了对EGFR治疗的疗效
(Gp:) Mutant KRAS +EGFR -EGFR
(Gp:) Wild type KRAS +EGFR -EGFR
(Gp:) Amado et al. J Clin Oncol 2008;26:1626-34
KRAS突变率: 32%
(Gp:) PIK3CA 突变率: 13%
(Gp:) BRAF突变率: 10%
传统肿瘤治疗:
Rx
治疗 化疗
Dx
诊断 分期、分级、 免疫组织化学检验
(Gp:) Rx
(Gp:) 治疗: 信号通路靶向治疗
个体化肿瘤治疗:
→
结肠癌中PI3K信号途径的159个基因指纹
信号通路和网络分析
Cho WC. Proteomics technologies and challenges. Genomics Proteomics Bioinformatics 2007;5(2):77-85.
Cho WC (ed). An omics perspective on cancer research. New York: Springer 2010.
谢 谢
- 标签：肿瘤
